肾脏病与男科杂志

来源文章
:2014  |  :1  |  问题 :1  |  :38--43

胶质细胞源性神经营养因子在精原干细胞增殖中的作用机制


胡建新1夏淑杰2,宋大龙3刘俊3孙兆麟3,  
1 上海交通大学上海第一人民医院泌尿外科研究所,博士后流动站,上海;贵州省人民医院泌尿外科,贵州贵阳550002
2 上海交通大学附属上海市第一人民医院泌尿外科研究所,博士后流动站,上海
3 贵州省人民医院泌尿外科,贵州贵阳550002

通讯地址:
孙兆林
贵州省人民医院泌尿外科,贵阳550002
中国

抽象

目标: 目的是通过检测GDNF,受体酪氨酸激酶(RTKs),fyn和粘着斑激酶(FAK)的表达来研究神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在精原干细胞(SSCs)增殖中的机制。基因干扰后的信使核糖核酸(mRNA)。 材料和方法: 设计并构建了多个GDNF的小干扰RNA(siRNA)以转染SSC。应用效率最高的GDNF siRNA,分别通过逆转录聚合酶链反应和western blot检测GDNF,RTK,fyn和FAK mRNA和蛋白的表达。用酶标仪和流式细胞仪分别检测SSCs的增殖和凋亡。 结果: 实验组和对照组SSCs中GDNF mRNA的表达强度为12.32。± 1.22% and 54.25 ±分别为1.34%;凋亡率为25.43± 1.91% and 5.61 ±分别为0.16%;两组之间有显着差异(P <0.01)。实验组RTK,fyn和FAK的表达强度为16.24。± 1.35%, 18.32 ± 1.34%, and 20.04 ±分别为1.65%;对照组RTK,fyn和FAK的表达强度为45.35± 1.37%, 38.37 ± 1.55% and 43.27 ±分别为1.28%;两组之间存在显着差异(P < 0.01). 结论: 这些结果表明,构建的阳性载体有效抑制了GDNF,RTK,fyn和FAK mRNA的表达以及SSC的增殖。 GDNF在SSC的增殖中起重要作用。



如何引用本文:
胡健,夏珊,宋丹,刘健,孙Z.胶质细胞源性神经营养因子在精原干细胞增殖中的作用。英法肾病Androl 2014; 1:38-43


如何引用此URL:
胡J,夏S,宋D,刘J,孙Z.胶质细胞源性神经营养因子在精原干细胞增殖中的作用机制。 J Integr Nephrol Androl [在线丛书] 2014 [引用 2021年1月30日]; 1:38-43
可从: http://www.topworldnet.com/text.asp?2014/1/1/38/137553


全文

 INTRODUCTION



在现代社会中,人们的身心健康受到不育等复杂因素的影响。越来越多的男性患有这种疾病,占已婚男性的13%〜15%。关于治疗,没有有效的方法用于无精子症。精子来自能够连续自我更新和分化的精原干细胞(SSC)。通过培养和诱导SSC在体外增殖和分化来培养精子是最有希望的治疗方法和研究热点之一。我们以前的研究和Spinnler等。提示神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)促进了体外培养的SSCs的增殖和分化,但机制尚不清楚。 [1],[2]

我们以前的研究表明GDNF可以促进精子发生。 [1]为了进一步研究其机制,本研究根据RNA干扰(RNAi)有效抑制靶基因表达和表达的特点,设计合成了针对GDNF基因的小干扰核糖核酸(siRNA)表达载体。促进SSC的增殖和分化。使用该载体,我们研究了GDNF基因干扰后SSCs的生长和增殖变化,以了解GDNF在精子发生中的机制。

 材料和方法



用料

从贵阳医学院的实验动物中心购买健康的雄性昆明小鼠(5-7天和12-15天,每个年龄组n = 40,无特定病原体)。其他试剂包括TRI REAGENT;RNA提取试剂盒(分子研究中心),DEPC(西格玛),氯仿,无水乙醇和异丙醇(中国石化化学试剂有限公司,上海),10 mmol / L脱氧核苷酸混合物(Invitrogen),25 mmol / L MgCl 2( Invitrogen),100 bpDNA(Invitrogen),质粒提取试剂盒(QIAGEN),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂​​盒(Invitrogen),琼脂糖(Biowest,西班牙),Taq聚合酶(TAKARA),T4-DNA连接酶(新英国),PCR凝胶提取试剂盒(QIAGEN),限制性内切核酸酶(新英格兰),PCR引物(中国上海桑贡生物技术有限公司),溴化乙锭(EB)(Sigma),λDNA / Hind III DNA标记(Promega),脂质体 ™2000(Invitrogen),PLKO.1 TRC(Clone TECH),高葡萄糖Dulbecco改良鹰之培养基(GIBCO),胎牛血清(FBS)(GIBCO),胰蛋白酶(GIBCO),磷酸盐缓冲液(PBS)(Hycone),辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠第二抗体(Santa Cruz),HRP标记的山羊抗兔第二抗体(Santa Cruz),GDNF多克隆抗体,基底膜基质BD Pharmingen)和增强的化学发光(ECL)发光试剂盒(Santa Cruz)。

重组质粒载体的构建与提取

在Gene-Bank中搜索神经胶质细胞源性神经营养因子信使RNA(mRNA),并根据siRNA的原理进行设计。用PLKO.1的慢病毒载体构建了具有GDNF敲低的慢病毒质粒。 GDNF敲低的序列是:GGGAC TCTA AGA TGAAG TTAT TTCAAG AGAAT AACT T CATCT TAGAG CCCTT;

siRNA GDNF1序列为:GCCATAC ACTT AAA TGTC AC TTT CAAGA GAAG TG AC ATTTA AGTGTA TGGCTT;

siRNA GDNF2序列为:GCTAA CAAGTG ACAAA GTAGGT TCAAGA GACCTA CTTTG TCAC TTGT TAGCTT;

siRNA GDNF3序列为:GCTAAA CGGTG TGGATG TATCTT CAAGAG ATAC ATCCA CACC GTTT AGCT。

酶切PLK O.1 TRC载体

在紫外线下收集酶消化的产物,并将其添加到预称重的1.5 mL Eppendorf(EP)管中以测量重量。加入3倍体积的QG后,混合物在50℃下完全熔化°C水浴,并加入1倍体积的异丙醇。将混合物置于柱上以沉降3分钟,以12,000 rpm离心1分钟,并沉降2分钟。流出物被丢弃。向该柱中添加0.5 ml QG缓冲液,并在12,000 rpm下离心1分钟,并丢弃流通物。将0.75 ml PE缓冲液添加到色谱柱中,沉降5分钟。以10,000 rpm离心1分钟后,将流过的液体弃掉。以15,000 rpm进行另一次离心1分钟。之后,将色谱柱放入1.5 mL EP试管中,并加入30 μ用于5分钟沉降的洗脱缓冲液,并以15,000 rpm离心1分钟。用1.5%的琼脂糖进行适当的离心分离以进行电泳和鉴定。

连接反应后的转化反应

20卷μ加入L的连接反应质粒DNA以融解100μ感受态细菌L(大肠杆菌DH5α)在冰浴中放置30分钟,然后加入42°C热冲击90 s,冰浴1-2分钟。将反应体系置于37℃的水平振荡器中°加入600后,以200 rpm的转速持续45分钟μL不含抗生素的Luria-Bertani(LB)溶液,然后均匀涂在涂有LB和100 mg / mL氨苄青霉素的板上。然后将板垂直放置在37°C放置1小时,然后在37倒置°C培养箱过夜,并保持在4℃°C用于将来的实验。

慢病毒包

293T细胞用胰蛋白酶在指数期以0.5的密度消化×10 6 / L,然后在37 mL的25 mL烧瓶(10 cm 2)和5%CO 2的培养箱中重新接种°C.当汇合度达到70-80%时,用慢病毒转染细胞。用无菌PBS除去培养基,并加入5mL无血清培养基。然后,在细胞中加入8μg PLKO. 1-GDDNF, 6 μg psPAX2, 2 μg pMD,然后加入最适基本培养基(MEM)至500μL,并在室温下放置5分钟。向另一个无菌EP管中添加450μL opti-MEM and 50 μ唇2000,并在室温下放置5分钟。然后将脂质体缓慢加入质粒DNA中,均匀混合并在室温下放置20分钟。将DNA和脂质体的混合物转移到含有单层细胞的培养基中,并均匀混合4-6小时培养。然后,丢弃含有转染混合物的培养基。然后将细胞用15mL PBS冲洗3次,并加入15mL含10%FBS的培养基。当培养基变成黄色时,收集转染的294T细胞,并加入含有10%FBS的新鲜培养基2次。将收集的上清液于4离心°C,4000 g,持续10分钟,新上清液用0.45过滤μm过滤并分成2 mL EP管,以备将来使用。

细胞转染

实验包括空白对照组,阴性对照组,短发夹RNA(shRNA)-120载体组,shRNA-494载体组,shRNA-634载体组和shRNA-743载体组。将靶向细胞接种在6 cm 2培养皿中,当融合度达到30-45%时,添加3 mL病毒上清液,2 mL含10%FBS的培养基和聚乙烯,终浓度为4-8μg / mL,最后在24小时后更改为普通培养基。

筛选出具有耐药性的稳定转染细胞

在48小时时,将细胞从培养基中移出,并加入嘌呤霉素培养基,终浓度为3μ直到对照组中所有细胞死亡。普通培养基改回来。

使用逆转录聚合酶链反应检测神经胶质细胞源性神经营养因子,受体酪氨酸激酶,fyn和局灶性粘附激酶的表达

根据试剂盒手册收集细胞并提取总RNA。用总mRNA转录该cDNA。反应体系为20.00μL,混合均匀,离心,放入PCR仪中。反应方案包含以下步骤:30°C 10 min, 42°C 30 min, 99°C 5 min and 4°C 5分钟该反应系统包含GDNF和GAPDH引物。 GDNF引物的序列为:5'-CACCGTT CTCCG AACGTGTCA CGTCAAGAG ATTAC GTGACACG TTC GGAGAA TTTTTTG-3'和5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACG TGTCAC GTAATCTCTTGACG TGACACGTTCGGAGA-3'。 GAPDH引物的序列为:5'-CACCGCTCACT CAAGATT GTCAGCAATTCAA GAGATTGCTGACAA TCTTGAGTGAGTTTTTTG-3'和5'-GATCCAAAAAACTCACTCA AGATTGTCAGCAATC TCTTGAATTGCTGACAATCTTGAGTGACC-3'。反应体系含10.00μL cDNA, 10.00 μL 5 × PCR buffer, 0.25 μL DNA聚合酶,1.00μL上游底漆,1.00μL下游引物27.75μL H 2 0, 10.00 μL cDNA,总体积为50.00μL.反应条件是在94℃预变性°C 2分钟,在94变性°C持续40 s,在57退火°C持续40 s,延伸至72°C进行1分钟,重复32次,然后在72处延伸°C持续10分钟。通过琼脂糖电泳测量产量,并用EB染色以保存。

蛋白质印迹法检测神经胶质细胞源性神经营养因子,受体酪氨酸激酶,fyn和粘着斑激酶的表达

用放射免疫沉淀测定溶液(Sigma)裂解细胞,并收集蛋白质。为了确保蛋白质样品的体积相同,使用Sangon Biothech Biotech Co Limited的试剂盒和二辛可宁酸法测量蛋白质浓度。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质

制备大约12%的分离凝胶,并将其倒入两个玻璃板之间的间隙中,并在顶部用1 mL ddH 2 O覆盖。自然固结后(37°C,10-15分钟),倒入ddH 2 O并用滤纸吸收。将5%堆积凝胶倒在分离凝胶上方,将梳子插入两个玻璃板之间,并除去气泡。样品与2混合×以1:1缓冲。拔出梳子,将凝胶放入电泳室中。上下插槽添加了1×Tris-glycin缓冲液(pH 8.3)。电泳以用于堆叠凝胶的8 V / cm和用于分离凝胶的12 V / cm进行。当EB移至底部约0.5 cm时,电泳停止。

电转移

将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和滤纸切成与凝胶相同的尺寸。将PVDF膜浸泡在乙醇溶液中,然后用两张滤纸转移至转移缓冲液(2.9 g / L甘氨酸,5.8 g / L Tris碱,十二烷基硫酸钠0.37 g / L和200 ml / L乙醇)。在转移缓冲液中冲洗凝胶15分钟。随后将垫,滤纸,凝胶,PVDF膜,滤纸,垫放入没有气泡的转移文件夹中。将转移夹放在电转移槽中,并使凝胶经受阴极处理。添加了转移缓冲液和冷系统。在100v下进行转移90分钟。

特异性抗体测量

印迹后,在室温下向PVDF膜中加入封闭溶液(Tris缓冲盐水[TBS],0.1%Tween-20、2%牛血清白蛋白)1小时,然后用TBS冲洗3次,每次5分钟。一抗用封闭液稀释(2μ将总体积为0.1 ml / cm 2膜的1 g / mL骨桥蛋白单克隆抗体或肌动蛋白抗体(1:1000)在室温下孵育1.5小时。用TBS冲洗PVDF膜3次,每次5分钟。混合ECL发光试剂A溶液和B溶液,并将其添加到PVDF膜中,在室温下反应1分钟。多余的液体被滤纸吸收。将PVDF膜放在两层防腐膜之间,并在黑暗中显影。

细胞增殖

将细胞接种在96孔板(100μL /孔,每孔5000个细胞),并在5%CO 2中于37℃预孵育°C.然后添加孔10μL / WST-1溶液/孔,并在培养箱中培养1-4天。用酶标仪在222nm处测量吸光度。

细胞凋亡

用不含乙二胺-四乙酸的胰蛋白酶消化细胞,用PBS漂洗2次,以2000 rpm离心5分钟,并以1的密度收集∼5 × 10 5 . Then, 500 μ加入L结合缓冲液以悬浮细胞,然后加入2μL Annexin V-荧光素异硫氰酸酯和5μ碘化丙锭(PI)并混合均匀。细胞在黑暗中于室温下反应5分钟。使用流式细胞仪(Ex = 488 nm; Em = 530 nm)测量细胞凋亡。

统计分析

数据表示为x-±并使用SPSS11.0:统计产品和服务解决方案11.0(SPSS公司,美国芝加哥)进行了分析。组间差异与方差分析进行比较。 P<0.05被设定为显着水平。

 RESULTS



质粒的构建

用pBSsi-GDNF DNA进行重组质粒的序列测定证实了与设计序列的一致性,表明成功构建了针对GDNF基因的siRNA载体。

胶质细胞源性神经营养因子信使核糖核酸在转染支持细胞中的表达

通过荧光显微镜和光学显微镜的比较,表明细胞的转染率达到>80%。各组在222 bp处均存在GDNF基因的电泳带,强度明显不同。 RT-PCR后,阳性转染组GDNF mRNA的电泳条带明显弱于对照组,而GAPDH在所有组中均相同[图1]。 ImageMaster TotalLab图像分析系统(英国TotalLab公司)显示,实验组和对照组中GDNFa mRNA的强度为12.32± 1.22% and 54.25 ±分别为1.34%和显着性差异(P< 0.01).{Figure 1}

转染后精原干细胞的凋亡

Annexin V和PI双染流式细胞仪检测结果表明,实验组和对照组的细胞凋亡率为25.43。± 1.91% and 5.61 ±分别为0.16%。实验组G2象限的凋亡细胞数明显大于对照组F2象限。两组之间的差异是显着的[[图2]; P = 0.035]。这些结果表明,有效的GDNF RNAi后,细胞凋亡显着增加。{图2}

核糖核酸干扰后精原干细胞中受体酪氨酸激酶,fyn和粘着斑激酶的表达

GDNF RNAi后SSCs中受体酪氨酸激酶(RTKs),fyn和粘着斑激酶(FAK)的电泳带明显弱于对照组[图3]和[图4]。用ImageMaster TotalLab分析表明,实验组中RTK,fyn和FAK的表达强度为37.34。± 4.23%, 28.77 ± 3.32% and 39.5 ±分别为6.02%;对照组RTK,fyn和FAK的表达强度为67.35± 5.22%, 66.75 ± 6.31% and 59.1 ±分别为6.35%。两组之间存在显着差异(P<0.01)。{图3} {图4}

 DISCUSSION



作为转化生长因子超家族的一员βGDNF由哺乳动物睾丸的支持细胞分泌。 [2] GDNF是精子发生的重要旁分泌调节剂,从精原子的生长,分化和增殖到精子发生的各个阶段均表达出来。未分化的精原细胞中有大量的GDNF受体。 GDNF在SSC的增殖和分化中起重要作用。 [1],[3],[4]多项研究表明,GDNF是哺乳动物睾丸中SSC增殖和分化的关键因素。 [5]在体外培养过程中,发现添加合适的GDNF可以促进SSC的增殖。进一步的研究表明,GDNF通过多组分系统起作用,该系统由与GDNF直接结合的膜外糖基磷脂酰肌醇耦合受体(GDNF家族受体)组成。α [GFR-α])[6]和跨膜酪氨酸激酶Ret。在SSC增殖过程中,主要的介导信号途径是GDNF介导的两个途径[7],其中Ret依赖性途径更为重要,并且主要由Ret RTK和GFR的复合体介导。α-l二聚体GDNF与单体或二聚体GFR-形成复合物α与Ret反应,导致Ret二聚体形成和Ret自磷酸化。 [8] Shc是一种编码SH结构域的蛋白质,另一种是连接蛋白。 Shc可以在酪氨酸位点被活化的Ret磷酸化,并与生长因子受体结合蛋白2(Grb2)/七少子(Sos)的儿子的复合物结合,从而使Grb2 / Sos成为活化受体。 Sos聚集在细胞膜周围并与血浆膜Ras结合,从而促进Ras鸟苷二磷酸转变为鸟苷三磷酸[9]并激活Ras,从而瞬时激活Ras / ERK1 / 2途径并导致磷酸化和激活转录因子,例如Creb-1,Atf-1和Crem-1。 [10]最后,GDNF / Ret / Ras上调瞬时反应基因c-fos和细胞周期调节蛋白A(Cyclin A)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的转录。细胞周期蛋白A是调节哺乳动物细胞周期S期并与CDK2结合的一种关键调节蛋白。另外,细胞周期蛋白A主要在精子发生过程中表达。细胞周期蛋白A1在精子的粗线期阶段高表达,是精母细胞所必需的。细胞周期蛋白A2主要在包括SSC在内的A型精原细胞中表达。因此,Creb和c-Fos增强了Gfr中细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的表达。α-1个阳性精原细胞,促进有丝分裂G1 / S的转化,加速进入S期,并促进DNA合成和细胞增殖。 [11]

另一个信号传导途径是Ret依赖性的,并且主要由神经细胞粘附分子(NCAM)介导,它在非Ret依赖性信号传导途径中起着重要的作用。 [12],[13] NCAM,一种在神经膜上广泛表达的粘附分子,可以与GFR结合αGDNF-1,激活下游fyn和FAK,[14],[15],[16]并促进过程的生长。

本研究应用RNAi沉默GDNF基因,表明精原细胞的生长受到明显抑制,增殖减慢,GDNF mRNA和蛋白表达降低。减少了GDNF介导的Ret依赖性途径和GDNF介导的Ret依赖性途径中的fyn和FAK表达。这些结果表明,抑制GDNF表达抑制了多种信号传导途径。 GDNF主要通过Ret依赖性和Ret无关的信号传导途径在精原细胞的生长和分化中发挥重要作用。

参考文献

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