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:2015  |  :2  |  问题 :3  |  :75--80

肾小管间质纤维化:动物模型中的审查。


赵杰1王力2曹爱丽2江民谦1陈霞1文鹏3,  
1 上海中医药大学普陀医院肾内科,上海200062
2 上海中医药大学普陀医院肾病实验室,上海200062
3 肾脏内科;上海中医药大学普陀医院肾病实验室,上海200062

通讯地址:
文鹏
上海中医药大学普陀医院肾内科,肾脏病实验室,上海兰溪路164号,上海200062
中国

抽象

肾功能恶化与肾间质纤维化(RIF)密切相关。使用动物模型,我们可以模拟疾病的病理变化和进展。 RIF的各种动物模型对于临床治疗和研究新药至关重要。本文回顾了常用的RIF动物模型的建立方法和机理,以帮助研究人员为不同的研究目的选择最佳的动物模型。



如何引用本文:
赵J,王L,曹A,姜敏,陈X,彭W.肾小管间质纤维化:动物模型研究。国际肾脏病学杂志,2015; 2:75-80


如何引用此URL:
赵J,王L,曹A,姜M,陈X,彭W.肾小管间质纤维化:动物模型研究。 J Integr Nephrol Androl [在线丛书] 2015 [引用 2021年1月30日]; 2:75-80
可从: http://www.topworldnet.com/text.asp?2015/2/3/75/161428


全文

 Introduction



肾间质纤维化(RIF)是不同肾脏疾病发展为慢性肾功能衰竭的常见途径和主要病理变化,也是决定肾脏功能进行性变化的关键因素。最近的研究表明,肾小管间质纤维化(TIF)不仅可以由肾小管间质疾病发展,而且还可以由某些肾小球疾病发展,并具有相互影响。此外,肾功能损害也与肾小管间质损伤密切相关,其严重程度预示了肾功能受损的程度,甚至超过了肾小球疾病引起的损害。 [1]因此,通过研究治疗方法并寻找新的药物以借助动物模型改善TIF的进展对治疗慢性肾脏疾病具有重要意义。

具有RIF的动物模型通常是通过药物如环孢霉素A(CsA),氨基糖苷类抗生素或肾毒性药物或通过手术如单侧输尿管阻塞(UUO),5/6肾切除术,肾脏缺血再灌注等方法建立的。

 手术诱发模型



单侧输尿管阻塞模型

单侧输尿管梗阻是研究RIF的发病机制并评估抗纤维化治疗的最常用动物模型。 1972年,Tanagho等人。首先通过结扎年龄70-75天的羔羊输尿管来介绍这种方法。后来,还提出了大鼠,负鼠,兔,猪,狗,猴子和其他动物来建立动物模型,但大鼠仍然是最常见的动物模型。输尿管结扎是最常用的方法,但结扎周围可能会形成新的管状器官,以允许尿液通过侧支途径流出。而且,周围组织的粘附增加了将来移除结扎的难度,特别是在成年大鼠中。一种解决方案是在输尿管周围放置小的血管夹,但是在尿液流出后很可能会发生输尿管损伤或错位。可以通过垂直结扎输尿管或使用平行套管产生部分阻塞来应用硅胶管。用成年大鼠建立UUO模型是一种更为方便的方法,但是当使用小鼠时,在异氟烷麻醉后的恒温操作控制台和视野清晰的显微镜不利于保持较低的发病率和死亡率。基于这些因素,操作者的灵活性,术后粘连和组织损伤也密切相关。 [2]建立模型:在无菌条件下用异氟烷/氧气吸入麻醉,然后下腹部正中切口。然后将左输尿管分开,并用5/0 Mersilk缝线在中间部分打结,然后在结扎带之间切开输尿管。然后用连续的腹膜缝合线和间断的皮肤缝合线闭合手术切口。 [3]建立模型的第7天为小鼠,第2-3周为大鼠。

最近的研究表明,UUO后RIF的机制如下:

巨噬细胞浸润,引起细胞因子释放,诱导肾小管细胞凋亡,激活并增加成纤维细胞的增殖;肾小球病变和肾小管萎缩,由肾小管细胞凋亡和坏死诱导;慢性UUO通过激活肾素-血管紧张素系统进一步调节凋亡前信号转导和随后的肾小管细胞凋亡而产生活性氧和核因子κB。相反,被替换的巨噬细胞产生抗炎因子,以刺激细胞存活和增殖。这两个因素共同导致代谢紊乱和血液动力学紊乱,随后是肾小管损伤,细胞凋亡或坏死和间质巨噬细胞浸润。间质成纤维细胞的增殖和成肌纤维细胞的表型转化导致细胞外基质(ECM)积累,最终导致纤维化。

间质纤维化是晚期肾病的常见病理变化,其病因多种多样。啮齿动物UUO模型导致进行性间质纤维化。它易于控制结扎诱导模型的时间,严重性和持续时间。它也很容易复制和可逆,并且可以在短时间内诱导纤维化。因此,当考虑间质纤维化的病因模式和机制时,它被认为是一种快速成功的模型,具有高成功率和低动物伤害性。但是,UUO可以通过急性机械损伤实现,并且可能不适用于所有的肾小管和间质损伤以及纤维化疾病。

5/6肾切除术

普拉特于1952年建立了5/6肾切除术的RIF模型,其中首先切除了左肾的2/3,然后在1周后进行了右肾切除术。观察到代偿性肾肥大,肾小球坏死,毛细血管壁塌陷,进行性系膜扩张,肾小管细胞萎缩,肾小管扩张,间质性炎症细胞浸润,纤维化和其他术后并发症。 5/6肾切除术模型是指通过右2/3肾切除术和左全肾切除术建立的残余肾脏模型。应用以下两个阶段的方法:[4]在第一阶段,通过安氟醚吸入麻醉大鼠,并将其置于恒温器操作台上,直肠温度保持在37-38°C.进行右胁切口以暴露右肾,并仔细解剖肾上腺和肾囊;然后,切除约2/3的右肾(包括上下两极)。 1周后进行第二阶段的手术​​,当用相同方法将大鼠麻醉后,在切除左肾上腺后切开左胁腹并完全切除左肾。对照组大鼠进行假手术,其中打开腹膜,但不切除肾脏。两组均在术后8-13周进行监测。一些研究人员还建议做一个2厘米的腹部切口,以暴露出脂肪组织和肾上腺,并用电刀切除左肾的1/3(包括上极和下极)。将剩余的肾脏放回原来的位置,并用6-0丝线缝合。大约一周后进行第二阶段,以5-0丝结扎椎弓根并切除右肾。对于假手术组,同时进行手术,但仅在小腹和表面切口处进行麻醉。 [5]

Ma和Xie提出了一种改进的方法[6],方法如下:Wistar大鼠用2%的戊巴比妥钠(30 mg / kg)麻醉,并在左胁腹切开斜切口。解剖脂肪囊并暴露肾动脉。靠近蒂的肾动脉的一到两个分支被夹住30秒钟以中断血流,相应的缺血区域以深紫色变成黑色。然后取下夹子以选择性地切除总共2/3的左肾,包括上极和下极以及外围区域。缺血范围和相关边缘被用作手术切除的参考部位。使用明胶泡沫止血,修复残余肾脏并缝合切口。 1周后切除右肾。共有5/6的肾脏是消费税。典型的病理变化包括肾小球肥大,肾小球细胞增生,肾小球壁粘连,血栓形成,肾小球纤维化,间质扩张,纤维组织增加,炎性细胞浸润以及局灶性肾小管萎缩和肥大并存。这种模型的建立是容易的并且高度可重复的,并且被认为是研究肾纤维化的发病机理和机制以及改善肾功能恶化的理想方法。

缺血再灌注模型

肾脏独特的结构,脉管系统和血液供应使肾小管对缺血和缺氧高度敏感。大鼠,兔子和狗是研究急性缺血性损伤的常用动物。缺血的时间通常为30-60分钟,通常在术前使用肝素以防止缺血性肾脏的肾内凝结。这种模型的肾脏损伤通常表现为肾小管上皮细胞刷状缘脱落,上皮细胞变性,坏死,脱落和凋亡,间质水肿和炎性细胞浸润。病理改变的程度与缺血再灌注时间密切相关,因此,它是急性肾小管损伤的经典模型。

Jain等人[7]使用雄性Wistar大鼠进行左肾切除术,并夹住右蒂45分钟,从而迅速诱发夜尿,间质纤维化和肾功能丧失。雄性大白猪(Le Magneraud,Surgθ,法国)也被其他学者用作动物模型。提供标准的食物和水。给予咪达唑仑滴鼻液(0.2 mg / kg)进行快速镇静,然后用氟烷和100%氧气进行吸入麻醉。该手术在无菌条件下进行。将20口径的导管插入耳静脉,然后将硫酸阿托品(10μ静脉注射,以减少咽和气管分泌物。轻轻解剖左蒂和输尿管,并在切除肾脏前10分钟迅速输注肝素钠(100 U / kg)。 [8]为了验证温暖缺血时间与不同肾单位状态之间的相关性,研究人员进一步采用了以下三组:双侧非创伤性椎弓根夹90分钟以诱导长期温暖缺血(WI90,n_7),单侧温暖缺血合并对侧肾切除术(50%的肾单位质量减少1 / 2N_90,n_7),以及对侧完整肾脏的单侧温暖缺血(WIuni90,n_7)。然后取下夹子以仔细监测足够的再灌注。在肾动脉中未观察到血栓。我们的结果表明,三种方法均成功建立了间质纤维化模型,其中单侧热缺血结合对侧肾切除术模型表现出最严重的病理改变。 [9]急性缺血性肾衰竭引起肾小管周围毛细血管永久性坏死,可能发展为进行性慢性肾衰竭。因此,缺血再灌注模型主要用于机理研究。

单侧肾静脉结扎

1988年,冈兹αlez-Avila等人[10]报道了大鼠单侧肾静脉结扎模型。通过腹膜内注射水合氯醛(0.1 mL / kg体重)麻醉30只体重200-250 g的雄性Wistar大鼠。暴露左肾静脉并结扎4-0缝合线。然后缝合切口,总手术时间为20分钟。该模型的优点是:

简单的手术技术,仅需进行肾静脉解剖和结扎;成本低;单侧手术后健康的对侧肾脏可以补偿,对动物的总体状况影响较小;实验时间短,其中模型在术后10天完成;病理变化理想地模拟了人类中发生的变化。

间质性充血和水肿发生在早期,伴有单核细胞浸润,胶原增生,肾小管上皮变性和萎缩性组织改变。在中晚期,通常观察到间质成纤维细胞增加,胶原蛋白分布,肾小管萎缩和坏死以及小动脉壁增厚。 [11]

 Drug-Induced Models



环孢霉素A肾病

环孢菌素A激活肾内肾素-血管紧张素系统,从而刺激OPN表达和巨噬细胞浸润并增强细胞凋亡,促进生长因子(例如转化生长因子-β1)释放,并与ECM聚集,诱导间质纤维化。体重为180-240 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠可以自由饮水和标准的无盐食物(AltrominW标准1320,含0.2%的钠,大号,德国),室温恒定,光照12h周期。每天用15 mg / kg /天的CsA灌胃大鼠(剂量根据体重增加而略有调整),共21天。 [12]还建议在低盐管饲法处理1周后,用橄榄油将CsA稀释至15 mg / mL,然后在接下来的4周内以1 mL / kg皮下注射[13]或将CsA溶解用橄榄油进行皮下注射,剂量为15 mg / kg /天。 [14]

CsA肾病模型通常用于研究CsA诱导的RIF的机制,并寻找预防CsA肾毒性的新药物。尽管该模型操作简便,成功率高,但由于成本高,肝脏毒性大,实验持续时间长和间质病变轻,因此其应用价值有限。此外,在所有病因中,CsA诱导的RIF的比例较低,其纤维化发展过程与典型的充血诱导的RIF不同。

阿霉素肾病

阿霉素(蒽环类抗生素)的成员阿霉素或阿霉素是一种抑制RNA和DNA合成的细胞周期非特异性药物,其中对RNA的抑制作用最强。 ADR在临床上主要用作化学治疗剂,可在细胞周期的不同阶段杀死肿瘤细胞。它通过代谢产生活性氧,从而在各种脂质介体的引导下诱导肾小球上皮细胞中脂质的过氧化,并破坏肾小球滤过屏障的结构和功能,最终诱导蛋白尿。 ADR诱发的大鼠肾病模型首先导致液泡变性,大量蛋白尿以及近端小管和破裂的肾小管基底膜逐渐充血,从而在间质中引起炎症反应和纤维化。 [15]当使用小鼠作为模型时,可使8-10周龄的Balb / c小鼠自由进食和饮水,并保持恒温和12小时的明暗循环。小鼠通过尾静脉静脉内给予10 mg / kg ADR,无需麻醉。病理表明,ADR引起肾小球和肾小管间质病变,皮质病变在7-14天后逐渐加重,并在第21天趋于平稳。[16]

阿霉素诱导远端小管中的蛋白铸型和充血性病变,基底膜损伤以及近端小管中的间质性炎症和纤维化。病理变化与人类相似,因此被认为是肾纤维化的经典模型。一个缺点是ADR的副作用。当泄漏到血管外时,可能会发生局部组织溃疡和坏死。 ADR在不同系统中具有不同的毒性。例如,它抑制骨髓中的造血功能,并可能在严重的心脏毒性中导致充血性心力衰竭。此外,还没有针对ADR引起的动物肾病模型的综合评估标准,这限制了该模型的评估和重复应用。

腺嘌呤诱发的肾病

1975年,罗斯等人[17]首先报道了腺嘌呤对狗肾脏功能的影响。 1986年,横泽等人[18]用腺嘌呤(150 mg / kg /天)连续灌胃17天,以建立慢性肾衰竭模型。还建议将C57BL / 6J小鼠放在带有木屑和纸卷的标准笼子中,室温为21-22 °在12小时的明/暗循环中,温度为40°C,湿度为40-50%。使所有动物自由饮水和食物,并在实验前适应性喂养1周。为了确保摄取腺嘌呤,将松果与酪氨酸混合以掩盖腺嘌呤的气味和味道。其他成分包括玉米淀粉(39.3%),酪蛋白(20.0%),麦芽糊精(14.0%),蔗糖(9.2%),玉米油(5%),纤维素(5%),复合维生素(1.0%),蛋氨酸( 0.3%)和胆碱酒石酸氢盐(0.2%)。总磷酸盐:0.9%,总钙:0.6%。喂养8周后,观察到肾小管间质中的成纤维细胞增生和间质纤维化。 [19]其他学者建议使用雄性SD大鼠,将其与0.7%的ADR混合进食连续14天。病理显示部分受损和萎缩,小管扩张,间质淋巴细胞和单核细胞浸润,其中观察到成纤维细胞增生和间质纤维化。 [20]

腺嘌呤诱发的肾病模型中的长期给药会诱发类似于人类慢性肾衰竭的代谢异常。通过调整剂量和给药时间,可以设计不同程度的慢性肾衰竭。该模型易于量化和复制,但是由于准备时间长和药物反应的个体差异很大,因此该模型的应用仍然受到限制。

马兜铃酸诱发的肾病

1993年,比利时科学家Vanherweghem等[21]首次报道称,含有方剂马兜铃和厚朴的中药“苗条丸”(减肥药)可能会导致进行性肾衰竭,并伴有快速进行性间质纤维化的病理,因此被称为“中药肾病”,或,“亚油酸肾病”。

Huang等[22]在8周龄的C57BL / 6小鼠中,通过腹膜内注射施用各种剂量的马兜铃酸I(AAI,Sigma I Aldrich,中国)。所有小鼠都在20℃喂食°室温和45%湿度的室温,光照/黑暗周期为12小时,可自由获取水和食物。结果表明,110 mg / kg AAI可在14天之内诱发由急性肾衰竭引起的死亡。肾小管细胞从基底膜脱落,引起部分肾小管充血。以2.5 mg / kg一次或两次(d1 + d14)给药不会在一个月内引起纤维化。每周连续两次四次以2.5 mg / kg的AAI给药以及疾病进展1周会导致周围皮质和延髓的部分肾小管损伤。每3天以3 mg / kg的剂量给药,持续6周,再加上6周,导致更严重的间质性肾小管纤维化。最后一种方法更适合病因分析,因为肾功能显着降低,周围皮质和髓质出现明显的肾小管间质纤维化,并且C57BL / 6小鼠的病变与人类一致。与人类慢性TIF相比,该模型具有相似的病理学特征,被广泛用于马兜铃属和细辛属植物的肾脏毒性研究。但是,模型准备大约需要6到21个月的时间,周期长,方法复杂,进给时间长,这些都会导致总成本过高,从而限制了其应用。

庆大霉素诱发的肾病

Gilbert等人[23]给大鼠服用40 mg / kg庆大霉素,持续14天,观察到肾功能衰竭和近端肾小管坏死。停药30天后发生间质纤维化。王飞等[24]每天两次给大鼠腹膜内注射80mg / kg /天的硫酸庆大霉素,持续9天,并在处死前5天和30天通过腹主动脉采血。对照组腹膜注射等量生理盐水。给药5天后,肾系数,血尿尿肌酐和血尿素氮明显高于对照组,在显微镜下观察到肾小管上皮细胞变性坏死,大量蛋白铸型和轻度细胞以及颗粒状铸型。出现肾小管萎缩和扩张,上皮细胞坏死,炎性细胞浸润,以及间质纤维组织和扩张性间质明显增生,但肾小球的结构保持完整。该模型主要用于研究氨基糖苷类抗生素对肾脏的损害,以进一步阐明药物通过肾脏的代谢途径及其肾毒性作用。

总之,有很多方法可以构建肾脏纤维化动物模型,每种方法都有其自身的优缺点。尽管手术引起的UUO模型易于在术中出血,并且对动物本身造成一定的损害,但它仍是建立均质病变的简便方法,准备时间短且可重复性高。因此,它被认为是病因和机制研究中应用最广泛的官方公认模型。药物诱发的模型和其他模型普遍存在准备时间长,病变不均一,费用昂贵,肾外损害,纤维化的晚期或微不足道出现,模型制备困难,标本收集困难以及评估标准多样且可重复性差的普遍缺陷。这些缺点在不同程度上限制了RIF研究的广泛应用。

 Acknowledgments



这项工作得到了中华人民共和国国家中医药管理局重点学科建设项目通用医学的支持;国家中医药管理局国家重点学科项目,上海市卫生局中西医结合人才项目(ZYSNXD012-RC-ZXY);上海市卫生局重点医学学科项目(ZK2012A34);普陀区科学技术委员会自主创新研究基金(2012PTKW002)。

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